Le sequenze genomiche della maggior parte dei virus sono note.Sonde di acido nucleico che sono brevi segmenti di DNA progettati per ibridarsi con segmenti di DNA o RNA virali complementari.La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica più efficiente per il rilevamento virale.Recentemente sono stati sviluppati metodi diagnostici ad alto rendimento.
A. Tecnica di ibridazione degli acidi nucleici
L'ibridazione degli acidi nucleici, che comprende principalmente il Southern blotting (Southern) e il Northern blotting (Northern), è una nuova tecnica in rapido sviluppo nel campo della diagnostica dei virus.La logica del test di ibridazione è utilizzare brevi segmenti di DNA (chiamati "sonda") progettati per ibridarsi con segmenti di DNA o RNA virale complementari.Mediante riscaldamento o trattamento alcalino, il DNA o l'RNA bersaglio a doppio filamento vengono separati in filamenti singoli e quindi vengono immobilizzati su un supporto solido.Successivamente, la sonda viene aggiunta e ibridata con il DNA o l'RNA target.Poiché la sonda è etichettata con isotopo o nuclide non radioattivo, il DNA o l'RNA bersaglio possono essere rilevati mediante autoradiografia o dal sistema biotina-avidina.Poiché la maggior parte dei genomi virali è stata clonata e sequenziata, possono essere rilevati utilizzando sequenze virus-specifiche come sonde nel campione.Attualmente, i metodi di ibridazione includono: dot blot, ibridazione in situ nelle cellule, DNA blotting (DNA) (Southern blot) e RNA blotting (RNA) (Northern blot).
Tecnologia B.PCR
Negli ultimi anni è stata sviluppata una serie di tecniche di amplificazione degli acidi nucleici in vitro basate sulla PCR, per testare virus insensibili o non coltivabili.La PCR è un metodo in grado di sintetizzare una sequenza di DNA specifica mediante reazione della polimerasi in vitro.Il processo di PCR comprende un ciclo termico di tre fasi: denaturazione, ricottura ed estensione. Ad alta temperatura (93℃~95℃), il DNA a doppio filamento viene separato in due singoli filamenti di DNA;quindi a bassa temperatura (37℃~60℃), due primer nucleotidici sintetizzati si ricoprono ai segmenti di DNA complementari;mentre alla temperatura appropriata per l'enzima Taq (72 ℃), la sintesi di nuove catene di DNA inizia dall'estremità del primer 3' utilizzando DNA complementare come modelli e singoli nucleotidi come materiali.Quindi, dopo ogni ciclo, una catena di DNA può essere amplificata in due catene.Ripetendo questo processo, ogni catena di DNA sintetizzata in un ciclo può essere utilizzata come modello nel ciclo successivo e il numero di catene di DNA viene raddoppiato in ogni ciclo, il che significa che la produzione di PCR viene amplificata a una velocità logaritmica di 2n.Dopo 25-30 cicli, la produzione di PCR viene identificata mediante elettroforesi e i prodotti specifici del DNA possono essere osservati alla luce UV (254 nm).Per il suo vantaggio di specificità, sensibilità e convenienza, la PCR è stata adottata nella diagnosi clinica di molte infezioni virali come HCV, HIV, CMV e HPV.Poiché la PCR è molto sensibile, può rilevare il DNA del virus a livello di fg, l'operazione dovrebbe essere eseguita con molta attenzione per evitare falsi positivi.Inoltre, un risultato positivo al test dell'acido nucleico non significa che nel campione sia presente un virus infettivo vivo.
Con un'ampia applicazione della tecnica PCR, vengono sviluppate nuove tecniche e metodi basati sulla tecnica PCR per diversi scopi di test.Ad esempio, la PCR quantitativa in tempo reale può rilevare la carica virale;La PCR in situ viene utilizzata per identificare l'infezione da virus nei tessuti o nelle cellule;La PCR annidata può aumentare la specificità della PCR.Tra questi, la PCR quantitativa in tempo reale è stata sviluppata più rapidamente.Molte nuove tecniche, come la sonda di idrolisi TaqMan, la sonda di ibridazione e la sonda beacon molecolare, sono state combinate in una tecnica PCR quantitativa in tempo reale, ampiamente utilizzata nella ricerca clinica.Oltre a identificare accuratamente la carica virale nel fluido corporeo dei pazienti, questo metodo può essere utilizzato anche per rilevare mutanti farmaco-tolleranti.Pertanto, la PCR quantitativa in tempo reale viene applicata principalmente nella valutazione degli effetti curativi e nella sorveglianza della tolleranza ai farmaci.
C. Rilevazione ad alto rendimento di acidi nucleici virali
Per soddisfare le esigenze di una diagnosi rapida di nuove malattie infettive emergenti, sono stati istituiti vari metodi di rilevamento ad alto rendimento, come i chip di DNA (DNA).Per i chip di DNA, sonde specifiche vengono sintetizzate e attaccate a piccoli chip di silicio ad altissima densità per formare DNA probe microarray (DNA) che può essere ibridato con il campione.Il segnale di ibridazione può essere ripreso dal microscopio confocale o dallo scanner laser ed essere ulteriormente elaborato dal computer ed è possibile ottenere enormi set di dati relativi a diversi geni.Esistono due tipi di chip del DNA.Il “chip di sintesi” è il seguente: gli oligonucleotidi specifici sono sintetizzati direttamente sui chip.Un altro è il chip del pool di DNA.I geni clonati oi prodotti della PCR vengono stampati ordinatamente sul vetrino.Il vantaggio della tecnologia del chip DNA è il rilevamento simultaneo di un'enorme quantità di sequenze di DNA.L'ultima versione del chip di rilevamento dei patogeni è in grado di identificare oltre 1700 virus umani contemporaneamente.La tecnologia del chip del DNA ha risolto i problemi dei metodi tradizionali di ibridazione degli acidi nucleici e ha applicazioni molto ampie nella diagnosi virale e nello studio epidemiologico.
Tempo di pubblicazione: 23-dic-2020